甲氧芐啶的作用機制主要是可逆性抑制二氫葉酸還原酶，使二氫葉酸還原為四氫葉酸的過程受阻，影響微生物DNA、RNA及蛋白質的合成，阻斷葉酸代謝，抑制細菌核酸蛋白合成。
甲氧芐啶是細菌二氫葉酸還原酶抑制劑，屬磺胺增效藥，用于對其呈現敏感的大腸埃希菌、奇異變形桿菌、肺炎克雷伯菌和某些腸桿菌屬、腐生葡萄球菌等細菌所致的急性單純性下尿路感染的初發病例。甲氧芐啶的抗菌作用原理為干擾細菌的葉酸代謝，可以選擇性抑制細菌的二氫葉酸還原酶的活性，使二氫葉酸不能還原為四氫葉酸，抑制細菌的生長繁殖。甲氧芐啶可用于治療敏感菌所致的中耳炎、傷寒、菌痢、敗血癥、腦膜炎等，但細菌較易產生耐藥性，很少單獨使用。
甲氧芐啶可分泌至乳汁中，其濃度較高，且藥物有可能干擾哺乳嬰兒的葉酸代謝，所以哺乳期婦女必須權衡利弊后決定是否用藥，用藥期間應定期進行周圍血象檢查，出現異常需要及時就診，及時調整治療方案。肝功能損害以及葉酸缺乏引起的巨幼細胞貧血或其他血液系統疾病，腎功能損害的患者應慎用該藥物。