甲氨蝶呤治療的起效時間不能一概而論，短至2-3周，長至2-6個月。起效的早晚與其治療疾病的類型、有無合用其他藥物、病人的病情等相關。
甲氨蝶呤主要用來治療急性白血病、絨毛膜癌、膀胱癌、惡性淋巴瘤、類風濕關節炎等多種疾病。如果是采用甲氨蝶呤單藥治療，起效的時間多在1-2個月逐漸起效。但如果是甲氨蝶呤與順鉑等化療藥物進行聯合應用，起效的時間會相應縮短，可能在2-3周的時間就可以起效。甲氨蝶呤治療類風濕關節炎，可達到抑制細胞增殖和復制的目的。在類風濕關節炎的治療過程中，一般主張小劑量應用，并且長期服用，甲氨蝶呤在用藥4-8周之后可以起效。而如果是急性白血病患者在服用甲氨蝶呤是通常3-4周見效，絨毛膜癌、膀胱癌等惡性腫瘤患者通常在用藥后2-6個月可見效，因此甲氨蝶呤見效時間具有一定差異性。
甲氨蝶呤的臨床應用過程中，起效的時間、療效的持續時間以及不良反應，與用藥劑量有一定的關聯。劑量越大，出現的不良反應會越多，不良反應的程度也會更加嚴重。所以在用藥的過程中，要對甲氨蝶呤的血藥濃度進行密切監測，如果出現不良反應，需要及時處理。